内蒙古自治区肿瘤医院检验科PCR实验室自2015年10月成立并通过认证以来,一直致力于肿瘤的分子检验,指导临床靶向用药,为患者的个体化治疗提供依据,使其从中获益。其中,主要针对肺癌患者的EGFR基因突变检测和针对结直肠癌患者的KRAS基因突变检测在全国卫生部临床检验质量控制中均获满分成绩。
目前循环肿瘤DNA(ctDNA)提取技术在EGFR基因检测中的应用优势日渐突显,其克服了晚期肺癌患者组织样本获取困难的劣势,只需抽取患者外周血10ml即可达到检测目的,使基因检测迈向了一个新的台阶。
当前两项检测均已纳入内蒙古甲类医保目录。
样本要求
1、检测所用样本类型为石蜡包埋病理组织或切片。
2、样本中癌细胞的含量应不低于整个样本的30%。含较大组织的蜡块建议切取10um厚的切片3~5片,较小或穿刺组织则为10片。
3、EGFR ctDNA:用5ml EDTA抗凝管采集患者2管血液直接送检。
4、EGFR 胸水样本:引流胸水50ml。
温馨提示:若组织未封片,可送检等量切好的蜡卷,无需特意制白片。
检测原理
采用ARMS-PNA技术,结合荧光PCR平台,检测人类EGFR基因上的29种不同突变,KRAS基因上12种突变。
PNA又叫肽核酸,是一种比DNA特异性更强的探针,它的Tm值很高,在退火时先和野生型DNA模板结合,能阻断大部分野生型DNA片段的扩增。ARMS技术则是利用PCR引物的3’端具有高特异性,如果引物的3’端和模板不匹配,则难以进行延伸。在引物设计的时候,将引物的3’端设计的与野生型片段不匹配,和突变型片段匹配,从而专一的扩增突变型DNA片段。两种方法结合最低可以检测到10ng基因背景下突变含量为1%的DNA样本。
这是实验中的外控基因检测体系,用于评估待测DNA的质量,同时还用于判定检测结果的阴阳性,从而排除因DNA浓度过低导致的假阴性检测结果,或因DNA浓度过高而导致的假阳性检测结果。
外控基因和样本基因扩增曲线比较。
检测结果
附几例检验科PCR实验室近期完成的典型阳性突变案例。
18外显子的G719X药物敏感性突变,该位点突变率仅5%
21外显子L858R药物敏感性突变。该位点突变率为40%~45%
20外显子S768I药物敏感性突变
19外显子19del药物敏感性突变+20外显子T790M耐药性突变
KRAS基因外显子2上G12D&G13D突变
KRAS基因外显子2上G12D&G12R突变
2017年EGFR第一次室间质评100分
2017年KRAS第一次室间质评100分
2017年EGFR第二次室间质评100分
2018年KRAS第一次室间质评100分
2018年EGFR第一次室间质评100分
为满足临床和广大患者需求,后续内蒙古自治区肿瘤医院检验科PCR实验室将持续开展EGFR/ALK/ROS1联合检测,KRAS/BRAF/NRAF等联合检测。
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